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        IZON qEV尺寸排阻柱
        IZON qEV尺寸排阻柱

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        IZON qEV 尺寸排阻柱,快速&可靠地純化細胞外囊泡

        功能:Izon qEV 柱從生物樣品中分離細胞外囊泡。(qEV 尺寸排阻柱只用于研究目的。)
        適用于 qEV 的樣品 1
        • 血清
        • 血漿
        • 唾液
        • 尿
        • 細胞培養(yǎng)液
        選用 Izon qEV 柱的優(yōu)勢包括 2
        • ~15 分鐘的分離時間
        • 極大程度地降低蛋白復(fù)合物產(chǎn)生和囊泡聚集的風險
        • 可以使用生理等滲的緩沖溶液
        • 是一種溫和、快速的方法,可以**程度地維持囊泡的生物學(xué)功能
        • 囊泡回收率為 50%或更高
        • 蛋白的去除比>1000 倍
        • HDL 純化>8 倍
        說明書
        樣品體積: ≤1 mL, 500 μL 為獲得**純度 EV 的優(yōu)化體積
        空隙體積: 3.0 mL ± 0.25 mL
        操作溫度: 15 至 25 °C
        流速 :在 18°C 時通常為 0.8 至 1.2 mL/min
        分離尺寸: 70 nm
        緩沖液: PBS
        床層體積: 10 mL
        **可通過尺寸: 1 μm
        頂部和底部過濾尺寸: 20 μm
        純化 pH 范圍: 3-13
        清洗 pH 范圍(CIP): 2-14
        保質(zhì)期 :3 個月(適當保存)
        **次使用后的壽命 :取決于使用方法與保存方法

        操作流程 3

        安全預(yù)防

        • 當使用 qEV 柱時采取適當?shù)膫€人防護措施,比如實驗服,手套和防護鏡。

        • 柱子的抗菌溶液包含 0.05% w/v 的疊氮化鈉。大量的疊氮化鈉有毒,所以應(yīng)該避免皮膚和眼睛的直接接觸。

        • 廢棄緩沖液應(yīng)妥善處理。疊氮化鈉會在銅制管道中累積引起爆炸。

        • 生物樣品可能有危險,當使用 qEV 柱時,請教實驗室安全員有關(guān)樣品安全操作的要點。

        保存

        柱子保存在含有抑菌劑(例如 20 %乙醇,或<0.05 % w/v 的疊氮化鈉)的溶液中,存放于+4到+8 °C。抑菌劑可以在沖洗步驟時引入(見囊泡收集后部分)。

        使用前

        如下圖所示:

        • 將柱子固定,使液面水平(確保柱子垂直)

        • 不要移除底部滑動蓋

        • 小心緩慢地移去頂蓋

        柱子的平衡

        • 移除底部滑動蓋,并且使用至少 10 mL 洗脫緩沖液(PBS)沖洗柱子。如果不是使用PBS 洗脫,那么至少使用 30 mL 洗脫緩沖液沖洗柱子。記下 5 ml 緩沖液通過尺寸排阻柱通過的時間,這可用于判斷何時需要清洗柱子。

        • 確認有充分的平衡時間使柱子溫度介于操作溫度范圍內(nèi)。

        • 不要使柱子變干。頂部的篩板必須保持濕潤。柱子變干會影響其功能。

        • 使用當天新配的過濾(0.2 μm)緩沖液避免引入顆粒物污染。

        • 為了**的結(jié)果,建議購買 Izon Prep and Reagent 試劑盒。

        • 如果在操作溫度范圍之外使用,可能會得到錯誤的結(jié)果。

        樣品的純化

        一.樣品的引入的應(yīng)用

        1. 在柱子移除底部滑動蓋之前,用移液槍移除篩板頂部的緩沖液。

        2. 加入 500 μL 樣品。

        3. 立即移去底部滑動蓋。

        4. 立即開始收集 0.5 mL 餾分;

        • *開始的六個餾分(3.0 mL)是空隙體積,不包含囊泡,通常無需分析。

        • 建議將空隙體積收集在同一個收集管中來節(jié)約時間,并可避免 6 個單獨的管子帶來的測量誤差。

        5. 當*后的樣品剛剛進入柱子頂部篩板(與之相平),加入更多的緩沖液,但是不要高于頂部篩板 2 mL。

        • 等待直到*后一滴樣品剛剛進入柱子頂部篩板,避免樣品稀釋。

        二. 樣品餾分收集

        當依據(jù)操作流程使用 qEV 柱時,EVs 大多數(shù)洗脫于餾分 7、8 和 9 中,去除了~99.8 %的蛋白;

        大于 10 的餾分包含更多的蛋白和更少的囊泡,不建議分析。為了得到更高的 EV 回收率,餾分可以合并起來,但是,合并餾分會稀釋 EVs 的濃度。

        方法 A — 得到**的純度和濃度

        不同的樣品會得到不同的洗脫峰形,因此建議預(yù)先測量 EV 濃度并對所有餾分(7 - 11)進行蛋白純化。

        1. 空隙體積之后立即收集 3 個囊泡餾分,每個餾分 500 μL(餾分 7、8 和 9)。

        2. 測量每個餾分的 EV 濃度(使用 Izon qNano)和蛋白純度。

        • 為了得到高濃度囊泡,使用** EV 濃度的餾分(通常 7 和 8)。注意:合并餾分會稀釋 EV 濃度。

        • 為了得到高純度囊泡,使用*低蛋白濃度的餾分。

        方法 B — 一般使用操作

        空隙體積之后立即收集一個囊泡餾分,1500μL。為了減少蛋白污染,建議只收集 1000 μL。

        三. 囊泡收集后

        當收集完囊泡餾分之后,用至少 10 mL 緩沖液沖洗柱子,并按照《保存》部分的要求保存柱子。記下 5 ml 緩沖液通過尺寸流過尺寸排阻柱所需要的時間,這對于檢測何時清洗柱子很有用。流速的改變可能暗示柱子被堵住或被污染。

        qEV 柱的維護

        再次使用

        如何檢測柱子何時被污染并需要清潔;

        • 流速相比初始流速開始變緩。因此建議測量初始沖洗流速(和/或空隙體積)作為對比。

        • 如果較先前相似的樣品來說回收率明顯下降,那么期望的 EVs 產(chǎn)率也相應(yīng)下降。如果是這樣,使用 Izon CPC100 校正顆粒(稀釋于 PBS 緩沖溶液中),收集餾分并使用qNano 測量至少 2000 個數(shù)。兩個峰值餾分的回收率應(yīng)該>50%。

        • 在沖洗完后,柱子頂端有顏色的變化。

        注意

        • 對于新的柱子和干凈或再生的柱子,頂蓋和凝膠表面之間的空間說明儲存過程當中凝膠有所沉降,并不影響其性能。為了使

        樣品的稀釋影響*小化,可以將頂蓋向下推動<2 mm。

        • 當囊泡餾分隨后被用于 PCR 或 RT-PCR 時,建議柱子單次使用。

        柱子的再生

        通常使用 20 到 30 mL 緩沖液清洗柱子,隨后使用新緩沖液平衡柱子(如果更換環(huán)境)。在一些應(yīng)用中,變性的蛋白或脂質(zhì)不會在再生步驟中被洗脫下來??梢酝ㄟ^下面的清洗步驟來去除。

        柱子的清洗

        去除沉淀蛋白、非特異性吸附蛋白和脂蛋白用 10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子,然后用至少 30到 50 mL 緩沖液沖洗柱子,并檢查洗脫溶液pH。

        去除強非特異性吸附蛋白、脂蛋白和脂質(zhì)

        用 20 mL 非離子型表面活性劑溶液,如 0.1 %Triton X-100 清洗柱子,然后用至少 20 到 30mL 緩沖液沖洗柱子。

        在某些情況下,一些樣品仍會殘留痕量蛋白。在清洗結(jié)束時再次檢查蛋白含量,如果蛋白水平高于預(yù)期,再清洗一次。

        柱子的消毒

        消毒可以**程度減少凝膠的微生物污染。用10 mL 0.5 M NaOH 清洗柱子。然后用 30 到 50mL 無菌緩沖液平衡柱子,并檢查洗脫溶液pH。

        注意

        • 脫氣緩沖液有助于避免凝膠基質(zhì)中氣泡的產(chǎn)生。少量的氣泡(<10)對柱效影響極小。

        • 建議使用 0.15 M 或更高離子強度的緩沖液,以避免溶質(zhì)與凝膠基質(zhì)之間產(chǎn)生不必要的離子相互作用。

        • 為了避免尺寸排阻柱的堵塞,建議過濾或低速離心生物樣品以去除大顆粒物。

        柱子的性能指標

        囊泡的峰值洗脫

        • 對于 500 μL 的樣品體積,囊泡的洗脫峰值在 4.0 mL ± 0.5 mL。

        • 兩個峰值餾分的回收率大約 50 %。

        • 對于 500 μL 的樣品,峰值餾分通常在餾分 8 和 9 之中。如果希望更高的純度,可以只收集*早的峰值餾分。

        通過測定 280 nm 處的紫外吸收可以得到 qEV柱的蛋白洗脫圖。通過 Bradford 法可以準確測定每個餾分中蛋白的精確含量。圖 1 展示了當500 μL 血漿樣品上樣至柱上時的囊泡洗脫圖。每個餾分的囊泡濃度通過 qNano 測量,蛋白含量通過 280 nm 處的吸收值來測量。

        囊泡的富集是十分明顯,它們主要存在于餾分7、8 和 9 中。血清蛋白的洗脫更慢一些,主要存在于餾分 11 - 30 中。大于 10 的餾分通常含有高濃度的蛋白和低濃度的囊泡,不建議用來做分析。

        EVs 的洗脫始于餾分 7,餾分 8 和 9 的濃度達到**。收集越多的餾分,EVs 的總回收率越高。

        圖 2 血漿中 EVs 的回收率說明了這點。但是,收集的餾分越多,EV 的回收濃度就會越稀釋。見表 1。

        上樣體積

        上樣體積越大,囊泡餾分中的囊泡純度越低。圖 3 展示了血清上樣體積為 100 μL,500 μL 和2000 μL 時的囊泡分布。2000 μL 的樣品導(dǎo)致囊泡**程度地被蛋白污染。2000 μL 樣品中外泌體的出峰延遲顯而易見。

        為了得到更純的 qEV,建議**的樣品體積為100 μL 至 500 μL,這樣囊泡會洗脫于餾分 7 至9 之中。

        圖 4 展示了血清上樣體積為 100 μL 和 500 μL 時的囊泡洗脫圖。

        囊泡的損失發(fā)生在當樣品體積大于 500 μL 時,囊泡的洗脫峰很寬以至于一些囊泡從餾分 11中被洗脫下來。這些餾分不建議用來分析因為包含了大量的干擾蛋白。

        純化

        圖 5 展示了餾分 7 到 9 之間含有很少量的蛋白,且越后面的餾分中蛋白含量越多。

        圖 6 展示了經(jīng)過 qEV 柱純化后,EVs 相對于蛋白的純化度。每個餾分的純化因子(純化前后蛋白的減少比例)如圖所示。餾分 7 和 8 富集的 EVs *多,也就是相對于回收的囊泡來說大部分蛋白被除去。

        qEV 柱純化過程中的稀釋

        為研究 qEV 純化過程中對樣本的稀釋,用已知濃度的聚苯乙烯納米顆粒標準品和脂質(zhì)體來模擬 EVs 的尺寸和組成。

        稀釋因子取決于哪些餾分被合并起來。起始體積為 500 μL 的聚苯乙烯納米顆粒標準品(直徑眾數(shù)為 400 nm)的總回收率為~100%。

        圖 7 說明合并餾分 5 至 11 可以得到 100%的顆?;厥章省_@導(dǎo)致稀釋因子為 7,并且收集的餾分含有大量的干擾蛋白,因此不適于實際應(yīng)用。

        表 1 展示了收集不同餾分的稀釋因子以及回收率。

        雖然可以獲得 100%的回收率,但是也可以通過測量每一個餾分的顆粒濃度,將濃度**的兩個餾分合并起來。因此回收率與純度之間存在折衷。當將餾分 7 和 8 合并起來時,脂質(zhì)體實驗的回收率為~50 %,與聚苯乙烯納米顆粒的結(jié)果相一致。

        依據(jù) EVs 的*終濃度,可以不稀釋餾分,直接用 qNano 來測量每個 餾 分 的濃度。對于qNano,每分鐘 500 到 1600 個顆粒是**速率。如果樣品速率高于這個范圍則需要進行稀釋。

        如果依據(jù)這個操作步驟來使用 qEV 柱,并且每個餾分的體積很精確的話,EVs 會始終洗脫于餾分 7、8 和 9,而餾分 10 和 11 中的含量很少。

        操作溫度

        qEV 柱經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制,流速大約 1 毫升/分鐘(±0.2 毫升/分鐘)。對于一些樣品來說,操作溫度可能會影響流速,*終影響 EVs的洗脫峰形。

        回收率的優(yōu)化溫度為在 15 °C 和 25 °C 之間 ,因此推薦的操作溫度為 15 - 25 °C 。

        大體積樣品的操作 4

        對于一些生物流體來說, qEV 純化前,可以通過將樣品預(yù)先濃縮來獲得更多的外泌體。根據(jù)所使用的樣品和其它制備步驟,此操作步驟可以根據(jù)需要相應(yīng)修改。

        1)取定量的細胞培養(yǎng)液,將樣品離心 1500 g,10 分鐘,隨后離心 3000 g,10 分鐘,取上清液。對于細菌細胞來說,則需要更高的離心力。

        2)用 Merck Millipore 離心裝置或等同的裝置來濃縮細胞培養(yǎng)液。Amicon Ultra 15 是一種 50mL Falcon 類型裝置,需要很低的離心轉(zhuǎn)速,*高 4000 g。這樣的話每次離心需要 15 分鐘。這個裝置可以將 15 mL 液體濃縮至 300-500 μL。

        3)如果樣品中含有不溶物,在 qEV 純化前10,000 g 離心 10 分鐘,去除沉淀。否則這些沉淀會對后續(xù) TRPS 分析造成影響。

        4)樣品經(jīng)過以上濃縮便可以按照上面第二部分來進行 qEV 純化了。樣品餾分收集見第 2 頁。

        qEV 餾分的 TRPS 分析

        對于 TRPS 分析來說,Izon Science 推薦使用Izon 試劑盒,這個試劑盒可以用來預(yù)涂納米孔并可以在整個操作過程中使用。

        在 TRPS 的準備階段和操作階段中,需要過濾所有試劑以避免污染或者大顆粒對 TRPS 濃度測試的干擾。Izon Science 推薦使用當天新配的過膜(0.22 μm 注射器式濾器)試劑。

        用 TRPS 分析 qEV 餾分時,Izon Science 推薦將餾分在初始電解液稀釋 1/5 或 1/10。優(yōu)化稀釋比例,使得**壓力下的通過速率為約每分鐘500-1600 個顆粒,以避免納米孔堵塞。

        如果對于 TRPS 分析來說囊泡濃度過低,需要濃縮樣品(見下面)。下面部分介紹 qEV 餾分收集后的樣品濃縮。

        qEV 餾分收集后的樣品濃縮

        對于小體積樣品或?qū)τ谏?EVs 的樣品來說,濃縮囊泡可以使分析變得更簡單。下面的方法可以在 0.5 - 1 h 之內(nèi)濃縮收集到的囊泡。

        通過 Merck Millipore Microcon-30 裝置濃縮小體積樣品(需要實驗室離心機達到 14,000 g 的離心力)。可以將 0.5 mL 樣品濃縮至大約 200μL。可以重復(fù)濃縮獲得更多的樣品(比如餾分7-9)。

        術(shù)語表

        色譜:一種樣品中成分分離的方法。由固定相和流動相組成,樣品的各組分在兩相之間分配。固定相可以是固體,固體支持液體或凝膠。固定相可被填充在柱中,伸展為固定層或分布為薄膜。流動相可以是氣體或液體。

        柱體積:填充材料和空隙體積的體積和(可簡稱為床體積)。

        餾分:表示從柱上收集的特定體積,對于給定體積數(shù)值恒定。也就是說,餾分 7 的 0.5 毫升是指收集的 3.0 毫升至3.5 毫升中的 0.5 毫升。

        脫氣:指將溶液抽真空來“煮”掉多余的溶解氣體,如將燒瓶抽真空。

        流速:載液的體積流量,單位為 mL / min。

        空隙體積:柱中固定相的總體積;柱子的其余部分由凝膠材料填充。它表示了 SEC 的排除體積。

        囊泡餾分:囊泡出現(xiàn)在的餾分。

        回收率:囊泡從柱子流出的量與進入柱子的量的百分比。

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