diSPIM是一種靈活和易于使用的實施選擇性平面照明顯微鏡（的SPIM），允許雙視圖（d樣品的），而安裝在一個倒置顯微鏡上（即SPIM的物鏡是直立）。diSPIM由NIH / NIBIB和應(yīng)用科學(xué)儀器（ASI）的Hari Shroff實驗室共同開發(fā)。SPIM也稱為光片熒光顯微鏡或LSFM，因為它使用光片或光平面垂直于成像方向照亮樣品。
什么是SPIM或LSFM？
選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）是一種快速而柔和的成像技術(shù)，將寬視野成像的速度與適度的光學(xué)切片和低的光漂白結(jié)合在一起。它已成為重要的熒光成像方式，尤其是對于體積成像。SPIM也稱為光片熒光顯微鏡（LSFM）或簡稱為“光片”。 SPIM或LSFM的定義特征是從側(cè)面對焦平面進(jìn)行平面照明。在任何給定時間僅照亮樣品的一小部分，從而使光損傷*小化，并且提供光學(xué)切片，與寬視野落射熒光相比，可以提高SNR。由于以廣角（二維平行）方式收集圖像，因此，光片成像比點掃描共聚焦顯微鏡要快得多，點掃描共聚焦顯微鏡一次只能檢測一個像素。
光學(xué)薄片顯微鏡由于以下三個關(guān)鍵特性而迅速在體積成像中獲得普及：首先，由于將激發(fā)限制在焦平面附近，因此光損傷*小化，例如，生物存活的時間更長。第二，獲得良好的光學(xué)切片，通常接近共聚焦顯微鏡。第三，采集速度非?？?，比傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡快幾個數(shù)量級。 SPIM的主要缺點是，需要額外的光學(xué)器件來生成光片。*常見的是，將一個單獨的照明物鏡與檢測物鏡正交放置，并將產(chǎn)生紙張的光學(xué)器件放置在該照明物鏡和激光源之間。添加額外的鏡頭會給成像系統(tǒng)和樣品安裝帶來空間限制。從本質(zhì)上講，顯微鏡需要圍繞樣品進(jìn)行設(shè)計，因此存在各種各樣的光片顯微鏡設(shè)計，每種設(shè)計都*適合不同的樣品和不同的安裝要求。相比之下，傳統(tǒng)的共聚焦或落射熒光顯微鏡只有一條光路，可以容納更多種類的樣品。換句話說，SPIM的優(yōu)點是以任何單個工具的適用范圍更窄為代價的。
方案
將兩個物鏡以直角放置在水平安裝在開放式培養(yǎng)皿中的樣品上方，每個物鏡與垂直方向成45度角。從一個物鏡創(chuàng)建一個光片，并使用另一個物鏡對其進(jìn)行成像。通過將光片移動通過樣品來收集一堆圖像。對于某些應(yīng)用程序，單個視圖或堆棧中的3D信息就足夠了（iSPIM）。對于雙視圖系統(tǒng)，兩個物鏡的作用相反，以從垂直方向收集另一個堆棧，然后可以將兩個數(shù)據(jù)集進(jìn)行計算合并以生成具有各向同性分辨率的3D數(shù)據(jù)集（克服了通常的軸向分辨率差的問題從其他視圖獲取信息）。因此，雙視圖diSPIM具有兩條（通常是對稱的）光路，包括兩個掃描儀和兩個攝像頭。
diSPIM“頭”可以安裝在各種倒置顯微鏡上，包括ASI的RAMM框架。diSPIM系統(tǒng)可以從各種系統(tǒng)集成商處獲得。各種開源和專有軟件包可用于數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)處理。不論所使用的系統(tǒng)集成商和軟件如何，大多數(shù)底層顯微鏡硬件都是相同的。
diSPIM目標(biāo)的選擇是有限的，因為它們必須共同聚焦而不互相碰撞。diSPIM的*常用物鏡是40倍水浸物鏡，NA為0.8（Nikon CFI Apo 40XW NIR）。奧林巴斯20x / 0.5物鏡是另一種可能性1）尼康10x / 0.3。ASI和Special Optics共同開發(fā)了一種適用于diSPIM的透明組織物鏡，該物鏡可以以平板形式或在12 mm球形包膜中對高達(dá)5 mm深的透明組織進(jìn)行成像。單面系統(tǒng)（iSPIM）具有更大的靈活性，因為照明物鏡可以是低NA長WD物鏡。 sCMOS相機(jī)*常用于SPIM成像。配備了Hamamatsu Flash4，Andor Zyla，PCO Edge和Photometrics Prime 95B相機(jī)的diSPIM系統(tǒng)。 ASI制造了緊湊的光纖耦合2D振鏡或“掃描儀”，它是系統(tǒng)的組成部分。掃描儀的原始版本通過在一個軸上進(jìn)行快速掃描來創(chuàng)建光片，并使用另一個軸將光片移動通過樣品2）。還提供帶有圓柱透鏡的掃描儀版本，用于產(chǎn)生靜態(tài)光片。激發(fā)激光（或激光發(fā)射）的輸出被簡單地饋送到掃描儀中。使用2×1光學(xué)開關(guān)或雙輸出激光發(fā)射非常有幫助，這樣激發(fā)就可以全部引導(dǎo)到有源光路中的掃描儀。
對于需要環(huán)境控制的應(yīng)用，diSPIM可以輕松地配備恒溫箱外殼和適當(dāng)?shù)脑O(shè)備，以保持樣品的存活和快樂。 底部物鏡（倒置顯微鏡）通常具有較低的放大倍率物鏡和較便宜的用于定位樣品的照相機(jī)?？梢暂p松添加落射照明。
優(yōu)勢
像其他光片技術(shù)一樣，diSPIM僅照亮聚焦平面，因此是使活細(xì)胞和生物成像的理想選擇，因為它**程度地減少了光漂白和光毒性效應(yīng)。與傳統(tǒng)或旋轉(zhuǎn)盤共焦系統(tǒng)相比，軸向分辨率提高了約2倍，光漂白減少了10倍以上，速度可與旋轉(zhuǎn)盤媲美。查看與confocal的更詳細(xì)的比較。 與許多其他光片實現(xiàn)相比，diSPIM的主要優(yōu)勢在于，與倒置顯微鏡類似，樣品的安裝非常簡單。*常見的是，將標(biāo)本放在24 x 50 mm的蓋玻片上，蓋玻片固定在一個特殊的腔室中，該腔室可容納浸漬介質(zhì)。具有開放式安裝的其他燈片實現(xiàn)不具有各向同性分辨率。查看光片法的更詳細(xì)比較。 除了方便定位樣品外，底部物鏡還可用于光操縱（包括光遺傳學(xué)）或其他實驗技術(shù)。它也可以用來提供樣本的第三張獨立視圖。這種靈活性也是diSPIM的獨特優(yōu)勢。 diSPIM是一種模塊化顯微鏡，因此可以根據(jù)您的特定需求進(jìn)行多種變化和添加。NIH研究人員，Applied Scientific Instrumentation等正在探索各種新功能和改進(jìn)。請參閱部分變體列表。 diSPIM系統(tǒng)可從多個系統(tǒng)集成商處購買。與其他商用輕型薄板解決方案相比，它們便宜且靈活。與定制的SPIM / LSFM系統(tǒng)相比，它們易于獲取，使用和維護(hù)。另請參見SPIM技術(shù)的更完整的技術(shù)比較。
配置
ASI提供了所有必要的硬件來實現(xiàn)diSPIM，這是一種靈活且易于使用的選擇性平面照明顯微鏡（SPIM）實現(xiàn)，可在安裝在倒置（i）上的情況下實現(xiàn)樣品的雙視圖（d）。顯微鏡。diSPIM“頭”可以安裝在各種倒置顯微鏡上，包括ASI的RAMM框架。 ASI制造光機(jī)械元件，包括電動平臺，用于創(chuàng)建和移動光片的2D振鏡，以及壓電物鏡移動器。需要物鏡，激光和照相機(jī)來完成系統(tǒng)；用戶可以自己購買其他物品，使用出售diSPIM的各種系統(tǒng)集成商的服務(wù)，或通過ASI購買它們。 diSPIM已在蓋玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞，嵌入在學(xué)院凝膠上的細(xì)胞c上成功進(jìn)行了測試。線蟲和斑馬魚的胚胎，以及許多其他樣本。
單面系統(tǒng)（iSPIM）
從一個物鏡創(chuàng)建并使用另一物鏡成像的光片。通常通過使用掃描儀（galvo）移動光片，使光片穿過樣品，該掃描器與移動成像物鏡的壓電平臺同步。
雙面系統(tǒng)（diSPIM）
雙方都有光片掃描儀，壓電物鏡定位器和相機(jī)。在實驗過程中，從兩個視圖中都收集了一堆圖像，并且可以將兩個數(shù)據(jù)集進(jìn)行計算合并以生成具有各向同性分辨率的3D數(shù)據(jù)集（另一個視圖中的信息克服了通常的軸向分辨率差的問題）。如果需要，可以單面模式運行。
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ASI光片熒光顯微鏡diSPIM的工作原理介紹？
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