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乳佐粒徑控制標(biāo)準(zhǔn)及解決方案

摘要：乳佐劑主要是由水相、油相、乳化劑和助乳化劑組成的液體。國內(nèi)外對乳佐劑已有廣泛研究，包括物料性質(zhì)、穩(wěn)定性、佐劑效果和安全性。乳佐劑的廣闊應(yīng)用前景促使科研工作者深入研究其增強(qiáng)免疫的機(jī)制，以期為新產(chǎn)品開發(fā)，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控及臨床應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。目的：粒徑大小是乳佐的重要性質(zhì)和評價指標(biāo)之一。方法：文中涉及的乳佐劑制備采用了高壓微射流均質(zhì)，采用動態(tài)光散射以及單顆粒光學(xué)傳感技術(shù)研究了乳佐粒徑分布狀態(tài)。結(jié)論：通過納米粒度儀以及全自動計數(shù)粒度分析儀可對乳佐的粒徑進(jìn)行多方位分析檢測。

關(guān)鍵詞：乳佐劑 納米乳 微乳  粒徑分布 均質(zhì)機(jī) 動態(tài)光散射（DLS） 單顆粒光學(xué)傳感技術(shù)（SPOS） 大乳粒

長期以來傳染性疾病一直都是人類健康的重大威脅之一，目前接種疫苗仍然是控制它的有效手段。在眾多行業(yè)黯然失色的年月里，疫苗行業(yè)這兩年反而激增，疫苗佐劑發(fā)揮了不可替代的作用。上世紀(jì)末，人們研制出水-油乳劑（Oil-water emulsion）類型的佐劑，并大規(guī)模用于疫苗開發(fā)和臨床試驗。

粒徑大小是微觀顆粒的最重要性質(zhì)和評價指標(biāo)之一。依據(jù)納米概念的定義，嚴(yán)格意義上將粒徑10~100nm的乳劑稱為納米乳，粒徑100~1000nm的稱為微乳。顆粒的細(xì)胞運(yùn)輸方式具有顯著的粒徑依賴性，較小粒徑的顆粒在作為疫苗佐劑時更具有潛在的優(yōu)勢。

乳佐劑一般需具有以下特征：

1. 均勻性好，運(yùn)載并保護(hù)抗原，能有效包裹或吸附抗原。

2. 增加抗原表面積及大小，改變免疫應(yīng)答的類型。

3. 緩釋抗原，乳佐劑能延長抗原或多肽的半衰期，使抗原與淋巴系統(tǒng)有充分的接觸時間，產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答。

4. 穩(wěn)定性好：物理穩(wěn)定性好且易過濾，經(jīng)熱壓滅菌或離心不分層，易于制備和保存，適合大規(guī)模生產(chǎn)。

 有研究表明，佐劑顆粒的大小影響免疫反應(yīng)的類型，200~600nm大小的顆粒容易通過淋巴結(jié)利用抗原遞呈細(xì)胞激發(fā)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，而2~8μm的顆粒則是由巨噬細(xì)胞的吞噬或胞飲作用運(yùn)輸至淋巴結(jié)，激發(fā)體液免疫。在研究SPO1微乳佐劑時發(fā)現(xiàn)150nm的顆粒佐劑效果較好，認(rèn)為該種粒子既能有效吸附抗原又能激發(fā)吞噬細(xì)胞的識別，而100nm以下的顆粒不能捕獲抗原，而200nm以上的則不穩(wěn)定或不引發(fā)理想的免疫應(yīng)答。有研究提出將500nm作為一個分水嶺，因為500nm以上和小于500nm的粒子激發(fā)完全不同的免疫反應(yīng)。乳佐劑雖然大小分布相對均勻，但其粒徑仍是一個范圍，以現(xiàn)階段的研究資料，通過單一儀器來進(jìn)行一個完全精確區(qū)分佐劑效果的界值相對還很難，我們以MF59為例，展示國際廠家在乳佐粒徑控制上，通過DLS和SPOS技術(shù)進(jìn)行的詳細(xì)控制要求。^[3]

1）初剪切制備初始乳液，初乳平均粒徑應(yīng)控制在300nm~800nm，且大于1.2μm的油滴數(shù)量應(yīng)控制在5*10⁹以下；

2）初乳經(jīng)過微射流均質(zhì)機(jī)處理以減少其液滴尺寸，微射流后的乳液平均粒徑應(yīng)控制在165nm以下，大于1.2μm的油滴數(shù)量應(yīng)控制在2*10⁸/ml以下；

3）微射流處理后的乳液經(jīng)過適當(dāng)?shù)挠H水膜過濾。過濾可去除前置工藝流程中的大油滴，這部分油滴雖然數(shù)目很少，但這些油滴體積可能很大，它們或可成為聚集的成核位點(diǎn)，導(dǎo)致儲藏過程中乳液降解。另外，過濾步驟可實現(xiàn)過濾除菌。過濾后的水包油乳液平均粒徑一般在155nm±5nm，大于1.2μm的顆粒數(shù)量控制在5*10⁵ml/ml以下。

 為了獲得穩(wěn)定的乳佐劑體系，乳粒的制備及表征至關(guān)重要。乳液組分可用Nicomp 380測定平均乳滴粒徑，可用Accusizer A7000 APS檢測大于1.2μm以上顆粒數(shù)。

結(jié)論：通過詳細(xì)控制要求我們可知 ，剪切后的初乳通過微射流均質(zhì)機(jī)進(jìn)行粒徑控制，在粒徑表征上，分別采用DLS進(jìn)行粒徑分布（平均粒徑、PI值等）和SPOS技術(shù)進(jìn)行尾端顆粒濃度控制（＞1.2μm的顆粒濃度）。

相關(guān)儀器如下：

微射流均質(zhì)機(jī)

品牌：意大利PSI，PSI-20，PSI-40系列（實驗室及中試型）；Infinity系列（生產(chǎn)型）

原理：高壓微射流均質(zhì)機(jī)通過電液傳動的增壓器使物料在高壓作用下以極大的速度流經(jīng)固定幾何結(jié)構(gòu)均質(zhì)腔中的微管通道，物料流在此過程中受到超高剪切力、高碰撞力、空穴效應(yīng)等物理作用，使得平均粒徑降低、體系分散更加均一，由此獲得理想的均質(zhì)或乳化結(jié)果。

制備關(guān)鍵點(diǎn)：均質(zhì)腔類型、均質(zhì)腔孔徑、均質(zhì)壓力

 應(yīng)用：對于不同領(lǐng)域的各類均質(zhì)需求，大致可以歸納為“乳化型”以及“解團(tuán)聚型”，針對乳佐劑可選擇“Y”型均質(zhì)腔，物料流體在加速過程中被分為兩股細(xì)流，通過細(xì)微空槽后正面碰撞混合，在獲得較高的結(jié)合相對速度時其本身所受的碰撞力較柔和，此過程有利于混合、乳化作用。另外WO 2011/067669里也有介紹，Z型腔在尾端大顆粒的控制上，要比Y型腔有更好的效率。

                                                                             儀器外觀

納米粒度及Zeta電位分析儀

 品牌：美國PSS，Nicomp系列

 原理：納米粒度儀采用動態(tài)光散射原理（DLS）檢測分析樣品的粒度分布?；诙嗥绽针娪竟馍⑸湓頇z測Zeta電位。其主要用于檢測納米級別及亞微米級別的體系，粒徑檢測范圍0.3nm-10μm，Zeta電位檢測范圍為±500mV。DLS從傳統(tǒng)的光散射理論中分離，關(guān)注光強(qiáng)隨著時間的波動行為。我們通過光強(qiáng)值的波動得到自相關(guān)函數(shù)，從而獲得衰減時間常量τ，跟進(jìn)公式換算獲得粒子的擴(kuò)散系數(shù)，再根據(jù)Stocks-Einstein方程計算粒徑大小。

 檢測關(guān)鍵點(diǎn)：粘度、折光率、溫度

 應(yīng)用：用于分析乳佐劑整體粒徑分布情況（包括平均粒徑、PI值、D10、D90等），判斷配方及工藝制備后粒徑大小是否符合要求。

                                                                             原理圖

                        儀器外觀

全自動液體顆粒計數(shù)器

 品牌：美國PSS,Accusizer系列

 原理：單個粒子通過狹窄的光感區(qū)時阻擋了一部分入射光，引起到達(dá)檢測器的入射光強(qiáng)度瞬間降低，強(qiáng)度信號的衰減幅度理論上與粒子橫截面（假設(shè)橫截面積小于光感區(qū)的寬度），即粒子直徑的平方成比例。用標(biāo)準(zhǔn)粒子建立粒徑與強(qiáng)度信號大小的校正曲線。儀器測得樣品中顆粒通過光感區(qū)產(chǎn)生的信號，根據(jù)校正曲線計算出顆粒粒徑。傳統(tǒng)光阻法的范圍下限一般到1.5μm。PSS開創(chuàng)性地通過光散射增加對小粒子的靈敏度，將單顆粒傳感器的計數(shù)下限拓展至0.5μm。

 檢測關(guān)鍵點(diǎn)：濃度、流速。

 應(yīng)用：定量分析0.5μm以上的顆粒粒徑分布以及濃度，彌補(bǔ)粒度分布儀器對尾端少量顆粒的不敏感性，從而判斷均質(zhì)工藝是否有效將尾端大顆粒進(jìn)行控制。針對乳液這類高濃度樣品，PSS粒度儀專為Accusizer A7000系列開發(fā)出的二部自動稀釋系統(tǒng)，該系統(tǒng)可將超高濃度樣品稀釋至目標(biāo)濃度，減少人工稀釋的誤差和時間成本。將樣品自動稀釋后，保證粒子“單個”通過傳感器，開始采集數(shù)據(jù)。系統(tǒng)跟進(jìn)稀釋因子自動還原樣品的原始顆粒濃度，解決了高濃度樣品的檢測難題。

                                                                                        儀器外觀

  乳佐劑作為載藥系統(tǒng)已引起廣泛關(guān)注并有所應(yīng)用，乳佐劑的均勻穩(wěn)定性及合適顆粒大小能保護(hù)并緩釋抗原，其增強(qiáng)免疫主要是基于納米顆粒的性質(zhì)和激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，并因顆粒大小的不同引發(fā)不同型的免疫反應(yīng)。從研發(fā)小試到工藝生產(chǎn)，通過表征數(shù)據(jù)來直觀判斷配方及工藝的有效性，對比不同配方及工藝對最終粒徑大小、顆粒濃度，通過這些數(shù)據(jù)指標(biāo)可適當(dāng)調(diào)整配方以及微射流均質(zhì)機(jī)壓力和均質(zhì)次數(shù)，進(jìn)而優(yōu)化制備工藝。

不同均質(zhì)壓力后體系尾端大顆粒濃度分布

紅色：800bar   藍(lán)色：1200bar

參考資料：

[1]趙蘭華, 李映波. 乳佐劑免疫機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2014, 43(2):4.

[2]Yu S,Tang C,S,Shi X,et al.Novel Th1 - biased adjuvant,SPO1,enhances mucosal and systemic immunogenicity of vaccines administered intranasally in mice(J).Vaccine,2012,30:5425 - 5436

[3]WO 2011/067669