精品国产午夜理论片不卡_99这里只有精品_黑人大战亚洲人精品一区_精品国产免费一区二区三区香蕉_99久久精品美女高潮喷水

利用BUCHI SFC系統(tǒng)

加速尿嘧啶和黃嘌呤類化合物的制備分離

尿嘧啶和黃嘌呤類物質(zhì)，即咖啡因、可可堿和茶堿，是一類在各種人類生物活動(dòng)過程中發(fā)揮重要作用的有機(jī)化合物。這些分子屬于雜環(huán)化合物類，其特點(diǎn)是含有既有碳又有氮原子的環(huán)結(jié)構(gòu)。尿嘧啶是 RNA 的基本組成部分，是構(gòu)成遺傳密碼并參與蛋白質(zhì)合成的核堿基之一。

另一方面，咖啡因、可可堿和茶堿這些黃嘌呤類物質(zhì)，是結(jié)構(gòu)相似但具有不同生物效應(yīng)的生物堿。這些黃嘌呤類物質(zhì)存在于各種植物來源中，是眾所周知的刺激物質(zhì)，能夠穿過血腦屏障并影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，目前成熟且廣泛應(yīng)用的分離方法往往是利用 RP-HPLC（反向色譜法）。

▲ 圖示：利用 YWG C18（150 x 4.6mm，5μm）色譜柱，7.5% 甲醇等度，10mmol/L KH2PO4-Na2HPO4 緩沖液（pH 5.0）分離混合物，紫外檢測波長 260nm。1.尿嘧啶；2.胸腺嘧啶；3.腺嘌呤；4.可可堿；5.尿嘧啶丙酸；6.茶堿；7.咖啡因[1]

關(guān)于此類應(yīng)用的反向色譜法已經(jīng)被優(yōu)化到了極致，因此在本文中，我們想嘗試以不同的方式來分離這些化合物，找出一個(gè)更快、更高效的解決方案。

SFC（超臨界流體色譜）是一種色譜技術(shù)，其移動(dòng)相的一個(gè)重要組成部分是超臨界二氧化碳。二氧化碳處于超臨界狀態(tài)時(shí)具有獨(dú)特的性質(zhì)，如高擴(kuò)散系數(shù)和低粘度，使其成為化合物分離和分析的優(yōu)良溶劑。SFC 相對(duì)于傳統(tǒng)色譜方法具有許多優(yōu)勢，包括更快的分析時(shí)間、更低的溶劑消耗以及在分離中的差異選擇性。此外，與 RP-HPLC 相比，SFC 代表了一種正交技術(shù)，為各種分析挑戰(zhàn)提供了互補(bǔ)的分離能力。

在 SFC 中，篩選色譜柱并找到最適合特定分離任務(wù)的固定相，是提高分離度的關(guān)鍵步驟。固定相是色譜系統(tǒng)的重要組成部分，因?yàn)樗苯佑绊戇x擇性。不同的固定相具有不同的化學(xué)功能和與樣品相互作用的能力，使其對(duì)特定化合物更具選擇性。通過篩選和選擇合適的色譜柱，可以優(yōu)化分離條件，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分析物的更好分辨率和靈敏度。

本文描述了使用 Sepmatix 8x SFC 平行色譜分析系統(tǒng)對(duì)尿嘧啶、咖啡因、可可堿和茶堿混合物進(jìn)行平行柱篩選，并隨后將方法放大到制備型 Sepiatec SFC-50 儀器的過程。

設(shè)備

▲ Sepmatix 8x SFC 超高效平行色譜系統(tǒng)

▲ Sepiatec SFC-50 制備色譜系統(tǒng)

色譜柱

• BUCHI PrepPure 硅膠, 5 um, 250 x 10 mm制備色譜柱

• BUCHI PrepPure 二醇基, 5 um, 250 x 10 mm制備色譜柱

• BUCHI PrepPure PEI, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure CBD, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure 硅膠, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure 二醇基, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure 氨基, 5 um, 250 x 4.6 mm

• BUCHI PrepPure 2-EP, 5 um, 250 x 4.6 mm

• Reprosil 4-EP, 5 um, 250 x 4.6 mm (Dr. Maisch GmbH)

• 氰基, 5 um, 250 x 4.6 mm, (Dr. Maisch GmbH)

1 試劑與樣品

• 食品級(jí)二氧化碳（99.9％）

• 甲醇（≥ 99％）

• 尿嘧啶（99+％）

• 可可堿（99％）

• 咖啡因（99+％）

• 茶堿（99％）

樣品準(zhǔn)備：在 50/2.5mL 甲醇/水中，溶入50mg 尿嘧啶，70mg 咖啡因，55mg 可可堿和85mg 茶堿，需加熱至 40℃，并配合超聲波輔助溶解。

2 實(shí)驗(yàn)部分

1、利用 Sepmatix 8x SFC 篩選色譜柱

篩選結(jié)果：

使用 Sepmatix 8x SFC 平行色譜儀器可以高效地同時(shí)篩選 8 根柱。因此，可以在很短的時(shí)間內(nèi)確定最佳選擇性。為此，使用了8種不同的固定相：硅膠、氨基、氰基、二醇基、2-EP、4-EP、PEI 和 CBD（型號(hào)請(qǐng)見上文），具體表現(xiàn)請(qǐng)看下圖。

▲ 圖示：8根不同固定相的色譜柱在分離尿嘧啶，咖啡因，可可堿和茶堿混合物時(shí)的表現(xiàn)。

結(jié)果顯示除了氰基、2-EP 和 4-EP 相外，所有其他固定相都可以分離樣品，因此我們需要分析最佳分離度的固定相。此時(shí)，分辨率（R）可以量化分析物之間的分離程度。

在處理復(fù)雜混合物時(shí)，R 值尤為重要，因?yàn)樗_保每種分析物都能被很好地分離并準(zhǔn)確識(shí)別和定量。R 為 1 表示峰根本沒有分離，實(shí)質(zhì)上是合并的，而更高的R值表示峰之間的分離更好。在實(shí)踐中，R 至少為 1.5 通常被認(rèn)為是適合進(jìn)行正確定量和鑒定分析物的。

• tR2 和 tR1 =組分 1 或組分 2 的保留時(shí)間

• W1 和W2 =組分 1 或組分 2 的峰高的一半處的寬度

我們將不同固定相的R值計(jì)算并列入下表進(jìn)行對(duì)比：

篩選和 R 值的評(píng)估顯示，硅膠、二醇基和 PEI 相具有最佳的選擇性來分離樣品，我們需要結(jié)合分離圖譜來篩選合適的固定相。在硅膠柱上，第一個(gè)與第二個(gè)峰并未呈現(xiàn)完全的基線分離。使用 PEI 相時(shí)，由于樣品分子的較高滯留性，運(yùn)行時(shí)間相對(duì)較長。而二醇基無論在分離度和時(shí)間上都有出色的表現(xiàn)，因此我們最終選擇二醇基作為制備分離時(shí)的固定相，色譜柱為 BUCHI PrepPure  二醇基, 5 um, 250 x 10 mm 制備色譜柱。

2、使用 Sepiatec SFC-50 制備分離樣品

在 SFC 上，我們可以通過堆疊進(jìn)樣的形式來制備純化，其生產(chǎn)率明顯高于通過多次進(jìn)樣進(jìn)行的梯度純化。由于堆疊進(jìn)樣只能在等度條件下進(jìn)行，因此需要先摸索不同等度比例下樣品分離效果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

▲ 圖示：33% 等度甲醇，4min 條件下，尿嘧啶，咖啡因，可可堿和茶堿混合物的分離效果

▲ 圖示：12% 等度甲醇，5min 條件下，尿嘧啶，咖啡因，可可堿和茶堿混合物的分離效果

由上圖可得知，33% 的甲醇條件下，尿嘧啶，咖啡因，可可堿和茶堿無法被完全分離，而 12% 的甲醇條件下，樣品分離度非常好。以此為基礎(chǔ)，我們進(jìn)一步去開發(fā)疊層進(jìn)樣的方法。

通過 Sepiatec SFC 的智能疊層進(jìn)樣時(shí)間推薦，我們把疊層進(jìn)樣的時(shí)間設(shè)置為 2.42 分鐘，既每 2.42 分鐘一次注入一次樣品，總計(jì) 8 次，上樣量增加到 0.12mL。

▲ 圖示：通過 2.42min 間隔的疊層進(jìn)樣在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行8次制備分離

▲ 圖示：多次進(jìn)樣的疊加圖片

每次進(jìn)樣的相應(yīng)疊加 UV 信號(hào)表明該方法具有良好的重現(xiàn)性，垂直線描述了收集相應(yīng)份數(shù)的時(shí)間窗口。

硅膠色譜柱的分離：

為了與二醇基填料進(jìn)行對(duì)比，我們也嘗試使用硅膠填料進(jìn)行疊層進(jìn)樣與分離，其參數(shù)如下：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

▲ 圖示：通過 2.15 min 間隔的疊層進(jìn)樣在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行 7 次制備分離

▲ 圖示：多次進(jìn)樣的疊加圖片

與二醇基相比，硅膠在 100bar 下表現(xiàn)更好，時(shí)間也更短。但是，在 R=1.57 的分辨率下，第一與第二個(gè)峰并不能理想地基線分離，會(huì)造成部分樣品損失。

2 結(jié)論

3 參考

1.韓金土, 樂良. 生物堿基及其衍生物的反相離子對(duì)色譜行為研究. 信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）第12卷，第2期，1999年4月