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在實(shí)驗(yàn)過程中,由于樣品的各種性質(zhì)差異,只有選擇了正確的離心方法,才能獲得預(yù)期的分離純化結(jié)果。常用的離心方法主要有差速離心法、密度梯度離心法。其中密度梯度離心法又可細(xì)分為速率區(qū)帶離心和等密度梯度離心法。本期向大家具體介紹離心方法之差速離心。
離心方法之差速離心
差速離心法(differential velocity centrifugation method)又稱離心力差分離法。
差速離心法原理
利用樣品中各組分沉降系數(shù)的差異,對不同的微粒施以不同的離心力,經(jīng)過多次離心,離心速度逐步加大,將不同的微粒依次沉降,從而實(shí)現(xiàn)離心分離。
差速離心原理可用離心力表達(dá)式說明:F=ma, 其中 a=ω2R。
由于小粒徑的微粒質(zhì)量小,分離時(shí)所需離心力大。為滿足大離心力的需要,必需提高其旋轉(zhuǎn)速度,方可分離。以不同的離心力分離不同粒徑的微粒是動力學(xué)的分離方法,特別是沉降速度差別較大的微粒多采用此種分離方法。
如果分離樣品中有大中小三種不同粒徑的微粒,對它們施以不同的離心力,大粒徑的微粒,其質(zhì)量較大,將會首先沉降;分離上清液,以更大轉(zhuǎn)速對上清液進(jìn)行第二次離心,中顆粒被分離出來;再取上清以更大離心力,更高的轉(zhuǎn)速,最后沉降小顆粒,以達(dá)到不同顆粒的分離,如圖1所示。
圖1差速離心
由于在每種顆粒的沉淀物中總含有部分次級顆粒,如想將某種顆粒提純,需對該顆粒的沉淀物進(jìn)行稀釋后再離心沉淀,最終可制備出理想純度的顆粒。
差速離心法之優(yōu)劣勢
差速離心主要用于分離直徑和密度差異較大的顆粒,其優(yōu)勢在于分離時(shí)間短、重復(fù)性高,樣品處理量大,可用于大量樣品的初分離。
但是在使用差速離心法分離復(fù)雜樣品時(shí),或分離純度要求較高時(shí),會需要多次進(jìn)行離心,操作繁雜;其次,由于沉淀的多次清洗、溶解及再沉淀,容易引起中間損失,會造成離心分辨力差的問題;此外,實(shí)際分離時(shí)由于離心時(shí)的對流、擴(kuò)散和收取沉淀時(shí)的污染,對于一些沉降系數(shù)相差不大的組分無法進(jìn)行完全的分離提純。由于差速離心法在樣品的純度和回收率方面的限制,它主要用于用于大量樣品的初步分離提純,為下一步檢測或?qū)嶒?yàn)做準(zhǔn)備。
例如,我們可以對動物肝組織勻漿液進(jìn)行多次的不同相對離心力和時(shí)間的離心和沉淀/上清分步收集,得到樣品的細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和核糖體等的初步分離富集沉淀,用于下一步的其他檢測或者精細(xì)純化實(shí)驗(yàn)。具體的處理流程如下:
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