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通過 SFC-UV/MS 分離西紅花主要提取物  

西紅花，又稱藏紅花，是世界上最昂貴的香料之一，其花朵呈現(xiàn)一種精致的紫色色調，內(nèi)部的絲狀紅色柱頭非常珍貴。在秋天，紅色柱頭通過手工采摘并分離，生產(chǎn)一磅(0.45公斤)的西紅花柱頭需要7萬朵花。這些紅色柱頭可以用作香料、染料并且具有藥用價值。

西紅花內(nèi)有非常多的提取物，主要成分為西紅花苷、苦番紅花素、西紅花酸等。其中許多化合物有公認的藥理活性， 比如西紅花苷在治療心血管疾病方面具有一定的作用。

西紅花苷存在于西紅花及梔子屬植物中，比較常見的分離法是采用高壓液相色譜法（HPLC），C-18色譜柱，流動相為水/乙腈或水/甲醇體系。初始梯度為高含水量，有機溶劑含量隨時間而增加，以洗脫非極性化合物，分離過程中也會加入甲酸以改善峰型。[2-6]

梔子類藥材中西紅花苷類成分的定性定量分析：

▲ 圖2：A.混合對照品；B.梔子；C.水梔子的 HPLC 分離圖

西紅花苷Ⅰ 5. 西紅花苷Ⅱ 8. 西紅花苷Ⅳ 17. 西紅花苷Ⅲ

Acchrom XCharge C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為乙腈（A）和0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序為：0～15min，22% A；15～30min，22%～25% A；30～35min，25%～28% A；35～50min，28% A；50～72min，28%～45% A；72～85min，45%～55% A；流速1mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長440 nm，進樣體積10μL。

本文介紹了一種利用BUCHI Sepiatec SFC-50分離西紅花柱頭主要提取物的方法。SFC-50內(nèi)置紫外檢測器并與MS（質譜檢測器）相連，從而判斷峰物質。

▲ 圖3：Sepiatec SFC-UV/MS系統(tǒng)

1實驗條件

2結果與討論

▲ 圖4：西紅花提取物在紫外波長440nm下的分離圖

用甲醇對西紅花柱頭的主要成分進行了提取后，得到的多數(shù)為極性化合物。圖4為紫外波長 440nm 下的分離圖。在前18分鐘，由于流動相為弱極性(86- 82% CO2)，紫外檢測器下無化合物被洗脫下來。當流動相的極性通過梯度增加時，幾種極性化合物被依次洗脫。其中的主要提取物西紅花酸易與幾種糖(葡萄糖、龍膽二糖和三氯蔗糖)結合形成西紅花苷。因為西紅花酸與糖分子的共價鍵導致極性的強烈增加，并使西紅花苷具有親水性，所以在氨基柱上的分離出峰時間比較晚[7-9]。

在質譜檢測上，我們使用電噴霧離子源（ESI），這是一種常壓下的溫和電離方法，可以在正離子(ESI+)或負離子(ESI-)下進行。在正離子模式下，通常會形成鈉加合物([M+Na]+)或質子加合物([M+H]+)。在負離子模式下，([M-H]-)離子通常是由于失去一個質子而形成的。根據(jù)樣品及其性質的不同，也可以形成多種帶電產(chǎn)物。

▲ 圖5：(a) UV-440 nm;(b) mass 999-999.5 (ESI+);(c) mass 836.9-837.4 (ESI+);(d) mass 674.8-675.3 (ESI+);(e) mass 975.5- 976 (ESI-);(f) mass 813.4-813.9 (ESI-);(g) mass 651.4-651.9 (ESI-);(h) mass 341.2-341.7 (ESI-)

▲ 圖6：西紅花苷Ⅰ(a) ESI+ and (b) ESI-, 西紅花苷Ⅱ(c) ESI+ and (d) ESI-, 西紅花苷Ⅲ (e) ESI+ and (f) ESI- 以及西紅花酸單甲酯(g)ESI-的質譜圖

圖5與圖6展示了西紅花甲醇提取物通過 Sepiatec SFC-50 結合 MS 檢測器后的分離圖譜，信號基于不同的 m/z（質子數(shù)/電荷數(shù)）。根據(jù)質譜結果我們可以推斷出表1的結構式結果。

▲ 表1：根據(jù)圖5推斷的西紅花主要提取物的結構式和摩爾m/z

西紅花苷Ⅰ是由西紅花酸和兩個龍膽二糖分子組成。在圖5中，該化合物 ESI+ 模式下的檢測 m/z 為 999-999.5，其加合物由鈉(m/z 23 g/mol)和樣品分子(m/z 976.4 g/mol)組成。在 ESI- 模式下也可以檢測到西紅花苷Ⅰm/z 為975.5-976。其對應的圖6質譜圖為(a)與(b)。

西紅花苷Ⅱ由西紅花酸、葡萄糖和龍膽二糖分子組成。在 ESI+ 模式(圖5(c))和 ESI- 模式(圖5(f))下，分別為(m/z 836.9-837.4[M+Na]+)和(m/z 813.4-813.9[M- H]-)。其對應的圖6質譜圖為(c)與(d)。

西紅花苷Ⅲ在 ESI+ 模式(圖5(d))和 ESI- 模式(圖5(g))下，分別為(m/z 674.8-675.3[M+Na]+)和(m/z 651.4-651.9[M-H]-)。其對應的圖6質譜圖為(e)與(f)。

西紅花酸單甲酯只能在 ESI- 模式(圖5(h))下鑒別，m/z為341.2-341.7[M-H]-。其對應的圖6質譜圖為(g)。

在 ESI 過程中，樣品分子會被碎片化，特別是在 ESI- 模式中。例如，西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ上的葡萄糖基團在ESI-模式下的脫離，導致其在圖5(g) m/z 651.4-651.9[M-H]- 中也被鑒定出來。

3結論

Sepiatec SFC-50 可以有效分離西紅花柱頭內(nèi)結構相似的提取物，為了鑒別里面的未知成分，采用 SFC-UV/MS 結合的形式，適用于多數(shù)天然產(chǎn)物應用。相比 HPLC 的流動相，超臨界二氧化碳具有高擴散系數(shù)和低粘度的特點，并且得益于二氧化碳的弱酸性，無需加入甲酸也能獲得不錯的峰型。在選擇性上，由于 SFC 屬于正相色譜，在出峰順序和時間上與傳統(tǒng)的 RP-LC 完全不同，這使得 SFC 在分離一些化合物組分時具備出峰時間上的優(yōu)勢。比如本次分離中的西紅花苷Ⅲ，在圖2的 RP-LC 中，出峰順序靠后，時間在 60 分鐘之后；而在圖5的 SFC 中，其出峰順序靠前，時間在 28-29 分鐘。這在分離一些極性偏弱的化合物時可以節(jié)省很多時間。