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        蛋白質(zhì),你知多少?

        蛋白質(zhì),你知多少?
        安東帕  2020-03-27  |  閱讀:1891

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        蛋白質(zhì)圖示

        沒有蛋白質(zhì)就沒有生命

        可見,蛋白質(zhì)對人體的重要性。

        蛋白質(zhì)是組成人體一切細胞、組織的重要成分,

        機體所有重要的組成部分都需要有蛋白質(zhì)的參與。

        一般說,蛋白質(zhì)約占人體全部質(zhì)量的18%,

        最重要的還是其與生命現(xiàn)象有關(guān)。

        成人每天的蛋白質(zhì)代謝情況


        人體每天需要從食物中攝取正常值的蛋白質(zhì),

        維持身體正常機制的運行。

        蛋白質(zhì)最常在體液或等滲緩沖液中再懸浮。然而,在這種高導(dǎo)電性溶劑上用電泳光散射(ELS)測量zeta電位可能會導(dǎo)致產(chǎn)生過量熱量,進而造成樣品降解和電極損傷。本文中,我們使用穩(wěn)定且可重復(fù)使用的Univette樣品池和Litesizer?500來測量溶解在等滲緩沖液中的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶菌酶的zeta電位。由于cmPALS專利技術(shù)和蛋白模式,該模式可以使測量過程短暫中斷,使樣品冷卻下來,能夠在不造成電極損傷的情況下獲得高重復(fù)性的zeta電位測量結(jié)果。

        簡介

        Zeta電位與粒子間斥力有關(guān),通常表征粒子懸浮液特性必需測量zeta電位。雖然很多物質(zhì)可以溶解或分散在去離子水中,但有些粒子需要分散在高導(dǎo)電性的溶劑中才能保持其結(jié)構(gòu),不會降解。這在生物樣品中尤其常見,因為蛋白質(zhì)、生物醫(yī)學(xué)聚合物和細胞必須溶解在緩沖液或等滲緩沖液中。

        利用電泳光散射(ELS)來測量zeta電位,這意味著在樣品上應(yīng)用了電場。這種測量技術(shù)的常見弊端是所謂的焦耳熱,即電流通過導(dǎo)體(樣品)會產(chǎn)生熱量。樣品的電導(dǎo)率越高,產(chǎn)生的熱量越多,這可能會導(dǎo)致樣品降解和電極損傷。這個問題對于生物樣品來說更為嚴(yán)重,因為生物樣品需要高導(dǎo)電性的溶劑,并且對熱解非常敏感。

        因此,對于這樣的樣品,關(guān)鍵是要保持盡可能低的電流,并使用盡可能短的測試時間。Anton Paar的Litesizer?500,獨有的cmPALS專利技術(shù)可以在較低的電壓和較短的測量時間內(nèi)實現(xiàn)穩(wěn)定靈敏的zeta電位測量,從而降低敏感樣品的應(yīng)力。此外,用戶可以激活一個稱為“蛋白模式”的軟件功能,它會在測量zeta電位時引入短暫的中斷,從而使樣品冷卻下來。

        Univette是一種可重復(fù)使用的樣品池,可用于在高導(dǎo)電性或有機溶劑中測量zeta電位,它足夠堅固,可以承受這種條件,并且不會造成電極損傷。

        本文我們演示了Litesizer?500和Univette的聯(lián)用性能,即使用Kalliope?的蛋白模式來測量標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶菌酶在高導(dǎo)電性溶劑中的zeta電位。

        實驗方法

        用卵清蛋白(Sigma-Aldrich)制備了兩種不同的溶菌酶溶液:

        • 0.1 mg/mL,溶于10 mM BisTris 緩沖液 (Carl Roth)和50 mM NaCl (J.T. Baker) 1:1的混合物中。

        • 1.0 mg/mL,溶于磷酸鹽緩沖液(PBS,Sigma-Aldrich)中。

        向Univette石英樣品池中加入900 μL樣品。第一次測量的平衡時間設(shè)置為2分鐘,連續(xù)測量30秒。每個溶液測試3個獨立樣本,每個樣本重復(fù)4次,共測試12次。表1總結(jié)了測量的輸入?yún)?shù)。

        樣品濃度

        0.1 mg/ml 

        1 mg/ml 

        溶劑

        10mMBisTris

        50mMNaCl (BisTris/NaCl) 

        1:1 混合溶液

        磷酸緩沖液(PBS)

        電壓

        5V

        3V

        運行次數(shù)

        20

        20

        重復(fù)次數(shù)

        4

        4

        蛋白模式

        表1:實驗設(shè)置


        Kalliope?軟件中的蛋白模式允許樣品在運行時冷卻,從而減少焦耳熱的影響。

         結(jié)果與討論

        在BisTris/NaCl中制備的0.1 mg/mL樣品的平均電導(dǎo)率為6 mS/cm,zeta電位為自動測量模式(表2)。該溶液的平均zeta電位為12 mV,如表2所示,如圖1所示。12次測量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%。

        樣品編號

        平均Zeta 電位[mV]

        相對標(biāo)準(zhǔn)偏差[%]

        電導(dǎo)率[mS/cm]

        1

        12.3

        3.64

        6.069

        2

        12.1

        6.09

        6.039

        3

        12.0

        4.38

        6.024

        1-3

        12.1

        4.57

        6.044

        表2:0.1 mg/mL溶菌酶在BisTris/NaCl中溶解的3個樣品的Zeta電位結(jié)果。每個值代表4個測量值的平均值


        圖1:0.1 mg/mL溶菌酶在BisTris/NaCl中的zeta電位分布圖


        PBS配制的1 mg /mL溶液的zeta電位值為9 mV,如表3所示,如圖2所示。然而,該溶液的平均電導(dǎo)率明顯高于BisTris/NaCl (29.4 mS/cm vs. 6 mS/cm)。

        盡管如此,測量值間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差是令人滿意的,平均值為7.2%(表3),遠遠低于ISO標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定的最大可接受重復(fù)性10%,這表明ELS不會導(dǎo)致樣品顯著的降解。

        經(jīng)過12次測量后對Univette的鈀電極進行目測檢查,也表明這些電極沒有受到任何可見的損傷(未顯示)。

        樣品編號

        平均Zeta 電位[mV]

        相對標(biāo)準(zhǔn)偏差[%]

        電導(dǎo)率[mS/cm]

        1

        9.5

        5.8

        30.78

        2

        8.8

        4.4

        28.92

        3

        8.8

        9.44

        28.50

        1-3

        9.0

        7.19

        29.40

        表3:溶解于PBS的3個溶菌酶樣品的Zeta電位結(jié)果。每個值為4個測量值的平均值


        圖2:PBS中1mg /mL溶菌酶的zeta電位分布圖

        結(jié)論

        從實驗中,證明了在高導(dǎo)電性溶劑中使用Litesizer?500和Univette可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的高重復(fù)性zeta電位測量。cmPALS專利技術(shù)可以在較低的電壓和較短的測量時間內(nèi)測量zeta電位,大大降低了施加在樣品上的應(yīng)力。這使得即使在低濃度(0.1 mg/ml)和高導(dǎo)電性蛋白樣品中也可以進行ELS測量。此外,Kalliope?的專用蛋白模式在ELS測試期間限制了焦耳熱,進一步有助于樣品和樣品池的保存。

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