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細(xì)胞系在某些培養(yǎng)條件下可能形成弱聚集的團(tuán)聚體和更難分離的聚集體，譬如人胚胎腎細(xì)胞（HEK）（1）。通過軟件算法準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)團(tuán)聚體和聚集體中的細(xì)胞數(shù)會(huì)有困難，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確。為了減輕這種情況，在取樣進(jìn)行分析之前，可能需要優(yōu)化樣品制備方法，以消除或減少較大的團(tuán)聚體和聚集體（2）。Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀集成了軟件功能，可以更準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行計(jì)數(shù)，在我們上一篇“團(tuán)聚細(xì)胞計(jì)數(shù)的應(yīng)用解決方案：Cell Type參數(shù)優(yōu)化”應(yīng)用短文中有更詳細(xì)的描述。

如果軟件不能有效識(shí)別和統(tǒng)計(jì)團(tuán)聚體和聚集體中的細(xì)胞數(shù)量，Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀軟件將統(tǒng)計(jì)這些較大的細(xì)胞簇，并在圖像中用紅色方塊標(biāo)記它們（下圖3）。由于軟件對(duì)大型（有時(shí)是三維）細(xì)胞簇的細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確，所以其中的細(xì)胞沒有統(tǒng)計(jì)。但是，軟件會(huì)統(tǒng)計(jì)并報(bào)告這些較大的細(xì)胞簇?cái)?shù)量。通過查看細(xì)胞簇的數(shù)量，您可以檢查特定樣本的聚集程度。由于大聚集體可能對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生負(fù)面影響，原因包括代謝擴(kuò)散減少導(dǎo)致細(xì)胞生長不良，以及質(zhì)粒和病毒顆粒無法到達(dá)內(nèi)部細(xì)胞，引起轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)效率下降從而導(dǎo)致滴度降低（3），因此這種情況最好停止培養(yǎng)。如果檢測(cè)確定細(xì)胞簇不可接受，但仍需要計(jì)數(shù)，則可能需要建立新的樣品制備過程。

對(duì)于在某些條件下難以分離聚集體的細(xì)胞系，如一些HEK293細(xì)胞培養(yǎng)，需要額外的團(tuán)聚分離優(yōu)化策略，即得到分離良好的細(xì)胞懸液由Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)。在本應(yīng)用短文中，我們描述了不同的分離介質(zhì)和移液吹打?qū)N壁HEK293細(xì)胞的聚集程度、存活率和活細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響。我們還提供了一種側(cè)樣制備技術(shù)，可以在Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上獲得更準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)結(jié)果，而無需改變傳代培養(yǎng)細(xì)胞的現(xiàn)有分離方法。

在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試了3種酶分離介質(zhì)：胰蛋白酶、含EDTA的胰蛋白酶和TrypLE。此外，用1000μL移液槍上下吹打，在單個(gè)樣品上測(cè)試每種分離介質(zhì)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在初始胰蛋白酶處理后采集側(cè)樣本，并用TrypLE處理。

分離介質(zhì)優(yōu)化過程

1、HEK293細(xì)胞在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長，在含有10%FBS的DMEM中融合率>70%。

• 分別準(zhǔn)備兩個(gè)培養(yǎng)瓶，用于測(cè)試胰蛋白酶、TrypLE和胰蛋白酶-EDTA作為分離處理

2、移除培養(yǎng)基，用5mL新鮮的無Ca2+、Mg2+離子的DPBS沖洗單層細(xì)胞。

3、加入2mL分離介質(zhì)，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶以確保單層細(xì)胞完全被覆蓋。培養(yǎng)細(xì)胞在37°C和5% CO2下孵育2分鐘。

注意：輕輕搖晃細(xì)胞上的培養(yǎng)基可以確保單層細(xì)胞完全被分離分離介質(zhì)覆蓋，但是，敲擊或搖晃培養(yǎng)瓶太劇烈可能會(huì)導(dǎo)致大簇細(xì)胞立即被移除。

4、孵育2分鐘后，細(xì)胞完全從培養(yǎng)瓶中分離出來，加入10毫升含有10%FBS的溫?zé)酓MEM，用10mL移液槍上下吹打5次，輕輕混合。

5、接下來將3mL培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到四個(gè)5mL試管中，將12mL培養(yǎng)細(xì)胞分開。

•  兩個(gè)試管被指定為未吹打?qū)φ?，兩個(gè)被指定為吹打后的樣品。

-對(duì)于吹打好的樣品，用1000μL移液槍上下吹打1000μL懸浮液10次。

6、將試管輕輕翻轉(zhuǎn)3次進(jìn)行混勻，將5個(gè)200μL的重復(fù)樣本分配到Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀樣品管中，并在Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上測(cè)試結(jié)果。

• 通過在樣品管和重復(fù)樣本之間交替分析吹打后樣品和未吹打?qū)φ掌返慕Y(jié)果。譬如，吹打管1-重復(fù)1，未吹打管1-重復(fù)1，吹打管2-重復(fù)1，未吹打管2-重復(fù)1。

7、通過使用Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上默認(rèn)設(shè)置和Mammalian細(xì)胞類型分析樣品。

8、對(duì)于每種分離介質(zhì)，兩個(gè)培養(yǎng)瓶中的樣品檢測(cè)重復(fù)該流程。

表1. 試劑清單

分離介質(zhì)優(yōu)化結(jié)果

與胰蛋白酶處理的樣品相比，胰蛋白酶-EDTA和TrypLE處理的樣品的平均細(xì)胞簇?cái)?shù)量顯著降低（p<0.05；Student's t-檢驗(yàn)），表明使用胰蛋白酶-EDTA和TrypLE進(jìn)行了更有效的細(xì)胞分離。胰蛋白酶-EDTA和TrypLE處理的樣品細(xì)胞簇?cái)?shù)量相似，表明兩種分離介質(zhì)的性能相似。胰蛋白酶-EDTA和TrypLE處理的樣品，吹打能夠顯著降低細(xì)胞簇?cái)?shù)量（p<0.05；Student’s t-檢驗(yàn)），表明通過移液槍吹打得到更弱的細(xì)胞簇，然而，吹打不能分離胰蛋白酶處理樣品中的聚集體。胰蛋白酶-EDTA和TrypLE的活細(xì)胞密度相似，組間無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05；Student's t-檢驗(yàn)）。在所有情況下，移液槍吹打都提高了存活率，這可能是由于在沒有團(tuán)聚體和聚集體的情況下采用了更有效的計(jì)數(shù)算法。

圖1: 三種分離介質(zhì)和吹打得到的平均細(xì)胞簇?cái)?shù)量，平均活細(xì)胞密度和平均活率結(jié)果。結(jié)果是每組所有試管和培養(yǎng)瓶的所有重復(fù)的平均值。使用JMP 16.1.0版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

側(cè)樣品分離方法

1、HEK293細(xì)胞在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長，在含有10%FBS的DMEM中融合率>70%。

• 準(zhǔn)備3個(gè)培養(yǎng)瓶來測(cè)試側(cè)樣品分離方法。

2、移除培養(yǎng)基，用5mL新鮮的無Ca2+、Mg2+離子的DPBS沖洗單層細(xì)胞。

3、然后，加入2mL胰酶介質(zhì)，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶以確保單層細(xì)胞完全被覆蓋。培養(yǎng)細(xì)胞在37°C和5% CO2下孵育2分鐘。

4、孵育2分鐘后，加入10 mL含有10%FBS溫?zé)岬腄MEM，用10mL移液槍上下吹打5次，輕輕混合。

5、接下來將3mL培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到四個(gè)5mL試管中，將12mL培養(yǎng)細(xì)胞分開。

• 兩個(gè)試管被指定為對(duì)照，另外兩個(gè)被指定為側(cè)樣品。

• 將兩個(gè)對(duì)照管翻轉(zhuǎn)3次，從每個(gè)管中取出3個(gè)200μL的樣品，并在Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上測(cè)試結(jié)果。它們被指定為未經(jīng)處理的對(duì)照組，代表了現(xiàn)有的傳代流程。剩余體積被指定為處理后的對(duì)照。

• 將兩個(gè)側(cè)樣品管翻轉(zhuǎn)3次，然后將所有4個(gè)管（兩個(gè)2400μL對(duì)照管和兩個(gè)3000μL側(cè)樣品管）在500 rcf下離心3分鐘使細(xì)胞沉淀。

6、離心后取出培養(yǎng)基，將細(xì)胞重新懸浮在400μL含10%FBS的DMEM（用于2個(gè)處理過的對(duì)照管）或500μL TrypLE（用于2側(cè)樣品管）中，然后用1000μL移液槍上下吹打10次以重新懸浮細(xì)胞。

7、在室溫下孵育2分鐘后，將樣品重新懸浮至初始體積（處理過的對(duì)照為2400μL，側(cè)面樣品為3000μL）。

8、用1000μL移液槍上下吹打樣品10次混合，然后將試管翻轉(zhuǎn)3次。

9、接下來，從每根試管中取五個(gè)200μL的重復(fù)樣本，在Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上測(cè)試，在處理過的對(duì)照試管和側(cè)樣本試管之間以及重復(fù)樣本之間交替測(cè)試，每種情況共測(cè)試10次。例如，處理過的對(duì)照管1-重復(fù)1，側(cè)樣品管1-重復(fù)1，處理過的對(duì)照管2-重復(fù)1，側(cè)樣品管2-重復(fù)1。

10、使用默認(rèn)設(shè)置和Mammalian細(xì)胞類型分析所有樣本。對(duì)總共3個(gè)培養(yǎng)瓶重復(fù)該流程。

側(cè)樣品分析結(jié)果

TrypLE處理的側(cè)樣本的細(xì)胞簇?cái)?shù)量明顯低于未處理和處理的對(duì)照組（p<0.05；Student's t-檢驗(yàn)）。經(jīng)過額外處理步驟的胰蛋白酶處理的對(duì)照組和經(jīng)TrypLE處理的樣本，VCD明顯高于未經(jīng)處理的對(duì)照組（p<0.05；Student’s t-檢驗(yàn)）。處理過的對(duì)照組較高的VCD可能是由于額外的混合和移液步驟導(dǎo)致團(tuán)聚體分離開。額外的處理顯著降低了處理后對(duì)照組相比未處理對(duì)照組的存活率，略微降低了1.5%（p<0.05；Student's t-檢驗(yàn)）。與未處理和處理的對(duì)照組相比，TrypLE處理顯著提高了存活率（p<0.05；Student's t-檢驗(yàn)），這可能是因?yàn)樵跊]有團(tuán)聚體的情況下計(jì)數(shù)更準(zhǔn)確。

圖2: TrypLE處理后側(cè)樣品，未處理對(duì)照和介質(zhì)處理后的對(duì)照。它們的平均細(xì)胞簇?cái)?shù)量，平均活細(xì)胞密度和平均活率結(jié)果。結(jié)果是每組所有試管和培養(yǎng)瓶的所有重復(fù)的平均值。使用JMP 16.1.0版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

對(duì)圖像的回顧顯示了胰蛋白酶處理樣本存在大的紅色框標(biāo)記和一些較小的細(xì)胞團(tuán)聚體（圖3左圖）。TrypLE處理的側(cè)樣本（圖3右圖）顯示了很少的細(xì)胞簇和較少的細(xì)胞團(tuán)聚體。

圖3: 胰酶對(duì)照組（左）和TrypLE處理后的側(cè)樣品（右）的圖像示例

討論

如前所述，分離方法的選擇會(huì)顯著影響存活率、活細(xì)胞計(jì)數(shù)和聚集程度。通過移液槍進(jìn)行溫和地吹打可能會(huì)分離弱聚集的團(tuán)聚體，并且允許在不降低細(xì)胞活率的情況下進(jìn)行更準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)。對(duì)于更大、更難分離且對(duì)移液槍吹打反應(yīng)不佳的細(xì)胞簇，用替代的分離介質(zhì)，譬如胰蛋白酶加EDTA或TrypLE，可以使細(xì)胞懸浮液更加分離。

最后，若繼續(xù)使用現(xiàn)有的分離方法，也可以選擇使用側(cè)樣技術(shù)，從而在Vi-CELL BLU細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀上實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的計(jì)數(shù)。

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