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        速率區(qū)帶離心法 |你的分離純化方法選對了嗎?

        速率區(qū)帶離心法 |你的分離純化方法選對了嗎?
        貝克曼庫爾特生命科學  2020-10-26  |  閱讀:2350

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        密度梯度離心(isodensity centrifugation method)又稱為區(qū)帶離心。

        QQ截圖20201026122844.png

        該方法的優(yōu)點是可以同時使樣品中幾種或全部組分分離,具有良好的分辨率,分離效果好,可一次獲得較純組分。

        缺點是離心時間較長,需制備梯度液,操作要求高。


        按照離心分離原理,密度梯度離心又可分為速率區(qū)帶離心法(rate zonal centrifugation method,R-Z)和等密度離心法 (isopycnic centrifugation method)。


        速率區(qū)帶離心也可稱為等區(qū)密度離心,是根據(jù)樣品中不同組分粒子所具有的不同的體積大小和不同的沉降系數(shù)將混合樣品進行離心分離提純。


        離心時將需要分離的樣品溶液置于由密度梯度材料(如蔗糖、氯化銫 (CsCI)、溴化鈉等)形成的梯度液柱上面,樣品粒子的密度必須大于梯度液柱中任一點的密度,否則無法得到理想的區(qū)帶離心效果。離心時,混合樣品中不同的組分將在梯度液柱的不同位置分別形成各自的區(qū)帶,選擇適合的轉速和時間進行離心,當各組分區(qū)帶距離拉得遠時,結束離心,然后將區(qū)帶取出。這樣只需通過一次離心就可以把混合樣品中的各組分分離提純,其純度和回收率均可滿足要求。


        優(yōu)點是一次分離純化,組分的沉降系數(shù)相差 20% 以上的即可選用此法,分辨力高,操作熟練可以將組分沉降系數(shù)相差 5%~10% 的樣品很好的分離。


        缺點是材料的條件限制,樣品液濃度不能太高,否則操作條件很難控制,同時此法與差速離心法相比,處理樣品的量要小的多。


        圖 1 速率區(qū)帶離心

        速率區(qū)帶離心的時間必須嚴格控制,不能太短,否則樣品區(qū)帶不清,時間也不能太長,否則待分離組分可能沉底。需要分離的樣品顆粒的沉降速度取決于顆粒形狀、大小、密度及離心力等因素。離心前后樣品的狀態(tài)如圖 1 所示。

        速率區(qū)帶離心經(jīng)典的應用就是通過蔗糖密度梯度離心,進行各種亞細胞器(核糖體、線粒體、Exosome 等)和病毒顆粒(病毒載體、疫苗等)的純化。例如,我們在上一期中得到的 70S 核糖體沉淀,經(jīng)過水解后,可利用蔗糖密度梯度離心,進一步分離純化得到 50S 和 30S 的兩個亞基。具體的實驗流程如下:

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        * 審批編號:RA-051-cent-adv-ruo

        * 修訂日期:2020/10/16

        * 聲明:未經(jīng)授權不得做任何修改,貝克曼庫爾特保留在不告知前提下隨時更新版本的權利



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