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【流式應(yīng)用知多少】21色實驗？其實也不難

貝克曼庫爾特生命科學(xué) 2018-10-22 | 閱讀：2671

我們知道流式實驗中抗體標(biāo)記的數(shù)量越多得到的信息就越詳細(xì)和準(zhǔn)確，以此同時，實驗操作也變得更加復(fù)雜。多色流式實驗中的補償操作，一直以來都是流式使用者非常關(guān)心的問題。甚至有人認(rèn)為，由于目前熒光染料的光譜普遍比較寬，可能會在相鄰的多個通道都造成比較大的干擾，因此很難在流式上完成超過18色以上的實驗。事實是否真是這樣呢？恰巧哈佛醫(yī)學(xué)院附屬麻省總醫(yī)院的Dr. Ravi Mylvaganam與我們分享了他在6激光21色的CytoFLEX LX上做的一個多色實驗。我們一起來看看。

Dr. Ravi Mylvaganam采用20個熒光抗體以及一個細(xì)胞死活染料組成21色的panel，可同時檢測多群記憶、效應(yīng)T細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，NK細(xì)胞甚至是干細(xì)胞樣T細(xì)胞等細(xì)胞亞群，詳細(xì)的抗體和染料標(biāo)記如下所示：

實驗樣本準(zhǔn)備步驟：
1. 標(biāo)記一個樣本管，在管中添加3 μL以下抗體：

1) CD3 BUV395
2) CD19 BUV496
3) CD56 BUV737
4) CD25 BV605
5) CD95 BV650
6) CD38 BV786
7) CD16 PerCP
8) CD4 PerCP-eFluor710
9) CCR4 PE-TexasRed
10) CCR7 PC7
11) CD8 AF790

2. 添加25 μL Brilliant Stain Buffer，渦旋混勻4秒；然后加入100 μL全血，再次渦旋混勻4秒后，在37oC下避光孵育20分鐘
3. 在試管中添加5 μL以下抗體：

1) CD57 Pacific Blue
2) CD45 Krome Orange
3) CD45 RA FITC
4) CCR6 PE
5) CD14 PC5
6) PD-1 (CD279) PC5.5
7) CD27 APC
8) CD127 APC-A700
9) CD28 APC-A750

4. 渦旋混合試管4秒后室溫避光孵育20分鐘
5. 在管中添加1 mL VersaLyse裂解液，渦旋混合2～3秒，室溫下避光孵育15分鐘
6 樣本200g離心5分鐘，棄去上清液
7. 在試管中添加5 μL IR Fixable染料，渦旋混合2～3秒，室溫下避光孵育20分鐘
8. 添加2 mL PBS重懸細(xì)胞，200g離心處理試管5分鐘，棄去上清液
9. 添加0.9 ml PBS和0.1 ml IOTest3固定液重懸細(xì)胞，可準(zhǔn)備上機檢測
10. 同時按照上述的孵育、離心操作制備單染管

實驗結(jié)果如下

從實驗結(jié)果圖可以看出，這個21色方案的結(jié)果分群清晰，不論是常規(guī)的CD3+CD4+Th細(xì)胞還是含量較低的Treg或者干細(xì)胞樣T細(xì)胞，都能很好的檢測到，看來對于CytoFLEX LX而言，21色實驗也不是一個難題。如果您需要該方案詳細(xì)的信息，可與我們聯(lián)系。

多色補償問題的簡化，與流式細(xì)胞儀技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)。遙想小編當(dāng)年，那個流式細(xì)胞儀用完后還要用紅布蓋起來的年代，我剛開始接觸的是一臺4色的流式，當(dāng)時4色實驗就是“多色”實驗了！那時沒有離線補償也沒有自動補償，流式也沒做得那么頻繁，調(diào)補償是相當(dāng)刺激的操作：先在17寸顯示屏上畫滿所有通道兩兩對應(yīng)的散點圖，上樣之后一定要眼疾手快反應(yīng)迅速默念“橫平豎直”，如果相關(guān)的門沒圈好，或者看到補償矩陣腦子蒙圈不知道調(diào)哪里，一著急就手足無措，經(jīng)常一管單染管跑完補償還沒調(diào)好所以實驗前師兄師姐往往要提醒“單染管多準(zhǔn)備點樣本”……

現(xiàn)在儀器的補償操作相比以前，我的天，簡直不要好太多！

拿這個做21色方案的CytoFLEX LX舉個栗子：

首先，它可以自動調(diào)補償，用戶只需要把單染管全跑一遍，圈好相應(yīng)的陰陽性細(xì)胞群，點擊計算補償就OK了，無論是2色還是21色都是這么簡單的操作。畫一堆圖看橫平豎直？不存在！

其次，它可以離線調(diào)補償。樣本比較多，想測完再拷回去慢慢分析？沒問題！

然后，CytoFLEX LX有補償庫功能，只要是做過的染料就可以把這個染料的補償信息存到庫里，以后做實驗可以直接讀取，避免需要重復(fù)做單染管的煩惱。最后，這個是壓軸的技能，方案里調(diào)好的補償會根據(jù)后續(xù)電壓的調(diào)整而自動調(diào)整。也就是說，以后做完補償，跑樣本時發(fā)現(xiàn)某個通道的電壓如果再調(diào)一點就完美了，如果是以前或其他儀器，您需要調(diào)整電壓后再重新調(diào)補償，而現(xiàn)在在CytoFLEX LX 上，您直接調(diào)電壓就好了！

其實很簡單，其實很自然，多色的補償并沒有那么難！雖然補償?shù)牟僮鞲悄芑?，但目前多色實驗中抗體和染料的選擇以及樣本的處理仍然是一門學(xué)問。如果您需要了解多色實驗更多的信息，比如染料的搭配和選擇，以及樣本處理的方法，您也可以聯(lián)系貝克曼公司索取資料。

* CytoFLEX LX流式細(xì)胞儀僅用于科研，不用于臨床診斷。