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【熱門應(yīng)用】乳清蛋白(WPI)在多檢測器SEC應(yīng)用表征

馬爾文帕納科 2022-09-14 | 閱讀：2815

1.什么是乳清蛋白？它有什么作用？

乳清是奶酪制作過程中的副產(chǎn)品，而乳清蛋白(WPI)是一種膳食補(bǔ)充劑和食品成分，是從牛奶中分離出來的。它含有很高比例的純蛋白質(zhì)，純度可達(dá)90%以上，幾乎不含乳糖、碳水化合物、脂肪和膽固醇。

乳清蛋白具有很高的營養(yǎng)價(jià)值，已成為各種保健食品中功能性成分的重要來源。它被廣泛用于嬰兒配方奶粉中，為最佳生長發(fā)育提供天然的氨基酸來源，也經(jīng)常在食品工業(yè)中用作乳化劑和穩(wěn)定劑。WPI在運(yùn)動員中也很受歡迎，因?yàn)樗軌虮环浅Ｑ杆俚叵?，并幫助鍛煉后的身體從分解代謝狀態(tài)恢復(fù)到合成代謝狀態(tài)。據(jù)有些應(yīng)用表明，WPI可能具有抗炎或抗癌的作用。

2.乳清蛋白是由什么組成的？

乳清蛋白由以下四種主要成分組成：

β-乳球蛋白

β-乳球蛋白是牛和羊乳清蛋白的主要成分，也存在于許多其他哺乳動物中。然而，它不存在于人類母乳中。大約85%的牛奶過敏性兒童在3歲前就不會過敏了，但其余15%的兒童仍對牛奶過敏。牛β-乳球蛋白是牛乳中的主要過敏原，因此乳制品生產(chǎn)商需要證明β-乳球蛋白的存在或不存在，以確保其標(biāo)簽滿足牛奶過敏癥的要求。β-乳球蛋白是一種相對較小的蛋白質(zhì)，由162個(gè)氨基酸組成，分子量為18.4kDa，在生理?xiàng)l件下主要以二聚體形式存在。

α-乳蛋白(α-lactalprotein)

α-乳蛋白(α-lactalprotein)是一種存在于幾乎所有哺乳動物乳汁中的蛋白質(zhì)，與乳糖的產(chǎn)生有關(guān)。分子量為14,178 kDa。

血清白蛋白

血清白蛋白是由肝臟產(chǎn)生的，其主要功能是作為血液中類固醇、脂肪酸和甲狀腺激素的載體蛋白，并通過增加腫瘤性壓力在穩(wěn)定細(xì)胞外液容量方面發(fā)揮重要作用。血清白蛋白是一種球形水溶性蛋白質(zhì)，分子量約為65 kDa。

免疫球蛋白(Ig)

免疫球蛋白(Ig)，也被稱為抗體，被免疫系統(tǒng)用來識別和中和異物，如細(xì)菌和病毒。在胎盤哺乳動物中有五種抗體亞型，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。典型的免疫球蛋白分子量為150 kDa。

在本文，使用OMNISEC多檢測器系統(tǒng)對WPI乳清蛋白樣品進(jìn)行表征。對混合物中的4種主要成分進(jìn)行了分離，并分別進(jìn)行測定。

3.乳清蛋白樣品表征方法

使用馬爾文帕納科的OMNISEC多檢測器系統(tǒng)對乳清蛋白樣品進(jìn)行分析，使用示差檢測器(RI)、紫外檢測器(PDA)、7°角光散射+90°角光散射(LALS/RALS)和粘度(IV)檢測器。樣品用馬爾文P柱(300×7.8 mm ID)分離，1×P4000和1×P3000柱分離。

流動相為0.1M pH7.0磷酸鹽緩沖液，每次進(jìn)樣總物質(zhì)約500μg。用OMNISEC軟件中的共聚分析計(jì)算對色譜圖進(jìn)行分析。所有蛋白的dn/dc是0.185。

4.OMNISEC分析結(jié)果

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色譜峰3的分子量為33 kDa，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%，與β-乳球蛋白相對應(yīng)，清楚地表明它是乳清蛋白中的主要成分。β-乳球蛋白單體的分子量為18.4kDa，但它在活性狀態(tài)下以二聚體的形式存在，因此，盡管略有差異，但33 kDa的峰仍然表明是二聚體。

α-乳蛋白(色譜峰4)的分子量為15 kDa，與理論值相符。一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是，α-乳蛋白的RI峰(測量濃度)的峰高不到β-乳球蛋白的一半，而兩者的紫外信號高度非常相似。這表明α-乳蛋白在280nm處的消光系數(shù)高于β-乳球蛋白。

根據(jù)分子量將70K峰和150K峰分別認(rèn)定為血清白蛋白和免疫球蛋白。所有四個(gè)峰的Pd值都很小，這與預(yù)期一致，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)總是有一個(gè)窄的Pd值。

從分離機(jī)理來看，流體力學(xué)半徑值隨保留體積的增加而減小，證實(shí)了低分子量蛋白質(zhì)的尺寸較小。特性粘度值也隨著分子量的增加而降低，但不是線性的，反映了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同。β-乳球蛋白二聚體的特性粘度最清楚地說明了這一點(diǎn)，盡管其分子量是α-乳球蛋白單體的兩倍，但僅比其值高出15%。這表明二聚體β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)比α-乳蛋白更致密。

聚集體

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在10-12mL的低保留體積下，LALS和RALS檢測器均出現(xiàn)單峰，而RI和UV檢測器則完全沒有峰。RI和UV信號與濃度成正比，因此該峰的濃度一定很低。

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從瑞利散射方程得知，光散射強(qiáng)度與分子量乘以濃度成正比，因此分子量必須非常大才能在光散射圖中顯示色譜峰信號。該聚集體以較低的保留體積洗脫出來，粘度檢測器中也沒有峰。這表明這些聚集體非常致密，具有較低的特性粘度，而不是纖維狀或其他結(jié)構(gòu)，因此粘度檢測器沒有檢測到色譜峰信號。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

Conclusion

本文數(shù)據(jù)表明，OMNISEC多檢測器系統(tǒng)可以用來表征復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物，如WPI中的蛋白質(zhì)。本文對乳清蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、β-乳球蛋白和α-乳蛋白的濃度、分子量、流體力學(xué)半徑和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，通過一次上樣測試，就可以得到全面的數(shù)據(jù)，測試過程簡單、高效、準(zhǔn)確。

同時(shí)，一些蛋白質(zhì)多聚體也可以清晰地被光散射檢測器識別出來，盡管這些聚集體的濃度很低。OMNISEC多檢測器系統(tǒng)在此類應(yīng)用中的拓展使用使其成為食品和營養(yǎng)方面或其他與蛋白質(zhì)相關(guān)的應(yīng)用（如生物制藥研究）的理想選擇。

OMNISEC

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